细菌治疗肿瘤的发展现状及趋势

现代医学的快速发展依然无法攻克多数晚期肿瘤无法治愈的难题，这极大促进了“非常规”治疗手段如病毒、细菌和疟原虫等治疗方法的发展。特别是Coley医生在19世纪90年代发明的细菌混合物治疗肿瘤的方法，因细菌简单易于操作的特点，再次成为21世纪的研究热点。

目前研究最多的肿瘤靶向细菌包括减毒诺维氏菌（Clostridium novyi-NT）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、双歧杆菌属（Bifido-bacterium）、大肠杆菌Nissle 1917（E.coli Nissle 1917）等，常被用于肿瘤的治疗。基于以上细菌构建的抗肿瘤工程菌可以单独治疗，联合化疗、放疗和免疫治疗等抑制或者杀死肿瘤细胞。同时，多种细菌及其衍生物制备的肿瘤靶向制剂已经进入临床试验阶段或者正在进行相关的临床招募。伴随着生物组学技术的发展，以及基因修饰技术的进步和免疫治疗的兴起，细菌治疗肿瘤出现了新的发展趋势。本文对近期细菌治疗肿瘤的最新研究进展进行了综述，并对其发展趋势、应用前景和存在的问题进行了相关讨论。

1细菌对肿瘤的靶向性

1.1实体肿瘤微环境

实体肿瘤微环境是设计和运用细菌靶向治疗肿瘤的基础。实体肿瘤不同于机体的正常组织，其具有低氧、低营养、低pH值和高渗透性的特点。在实体瘤体积不断增大的过程中，正常组织的局部血管不足以维持肿瘤细胞的生长，从而触发肿瘤血管生成因子的释放来形成新的血管网，失去正常的血管结构。这种混乱、不稳定的新生血管网络主要分布在肿瘤组织外围，使得肿瘤内部氧气和营养供应不足，肿瘤部位出现了暂时性或持久性的缺氧状态，同时生成坏死组织。为了应对缺氧，肿瘤细胞会通过糖酵解和无氧呼吸来供给能量，但会产生乳酸，使肿瘤部位的pH值低于正常组织。而实体瘤致密的细胞外基质和较高的细胞密度，导致肿瘤内部形成了较高的渗透压，从而阻止药物分子向缺乏血管的实体瘤内部渗透。由于实体肿瘤微环境的特殊性导致目前的临床治疗手段效果较差，因此，我们急需寻找新的高效的肿瘤治疗手段。

1.2细菌自身特性及对肿瘤的靶向能力

在自然界中，部分细菌能够特异性地靶向实体瘤，克服实体肿瘤低氧、高渗透压的微环境，进入肿瘤的坏死区生长繁殖。例如，减毒诺维氏菌和双歧杆菌属偏爱无氧环境，静脉注射后会自动地聚集在肿瘤部位，而在正常组织中不能生存，这有效避免了细菌对正常组织细胞的损害。正常情况下，药物只能被动地随着血液流动，导致到达肿瘤的药物浓度随着距离的增大而相应地减少。同时，由于肿瘤内部血管缺乏以及高渗透压微环境使得药物无法进入肿瘤内部。

而细菌作为生物体，在趋化因子和高渗透长滞留效应（enhanced permeabil-ity and retention effect，EPR）的作用下靶向聚集到肿瘤中，借助于其鞭毛运动进入实体瘤内部生长繁殖。一些研究表明，鼠伤寒沙门氏菌不管是在体外还是体内，其遗传物质经多代繁殖后依旧保持稳定，这为构建肿瘤靶向工程菌奠定了坚实的基础通过DNA重组技术可以对肿瘤靶向细菌进行基因改造，产生肿瘤靶向性更高、毒性更小的细菌菌株，用于肿瘤的靶向治疗。

事实上，兼性厌氧菌对肿瘤的靶向性低于专性厌氧菌，但是其更易于在体外进行修饰改造的便利性使其成为主要的研究对象。通过基因改造可以有效提升兼性厌氧菌的肿瘤靶向性。例如，将鼠伤寒沙门氏菌株生长所必需的基因asd置于低氧启动子PpepT之后，使得该菌株只能在低氧的肿瘤环境中生长繁殖，而当在有氧的正常组织中，有氧启动子PsodA会促进asd基因的反义转录，使得其无法在正常组织中存活（图1）。

更重要的是，细菌不仅可以进入实体瘤内部，还可以随着肿瘤细胞进行转移。鼠伤寒沙门氏菌经静脉注射小鼠后，该细菌出现在肿瘤的每一个转移灶中。其中，44.0%的细菌都分散在肿瘤转移组织中，而只有0.5%的细菌存在于正常的肝组织。另外，αvβ3整合素通常在活化的内皮细胞和部分肿瘤细胞膜上高表达，而精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）对其具有高度靶向性。通过DNA技术在鼠伤寒沙门氏菌细胞膜上表达RGD多肽，可以显著增加其对肿瘤的靶向性（图1）。

图1基因修饰和肿瘤靶向分子镶嵌增加细菌的肿瘤靶向性

Fig.1 Increasing bacterial tumor-targeting ability using gene modification and molecular decoration

（a）基因修饰。必需基因（asd）在缺氧启动子（PpepT）的控制下表达，有氧启动子（PsodA）会促进asd基因进行反义转录；（b）通过在细菌表面修饰小分子、多肽和抗体等肿瘤靶向分子增加其肿瘤靶向性。

(a)Gene modification.The hypoxic microenvironment of solid tumor activates hypoxia promoter(PpepT)to enhance the expression of essential gene

(asd)while aerobic promoter(PsodA)promotes antisense transcription of asd gene and silences the gene in the normal organs;(b)Modification of

bacterial membrane with small molecules,peptides,antibodies and other tumor-targeting molecules for enhancing their tumor-targeting ability.

另外，在细菌表面表达癌胚抗原的特异性抗体（antibody），不仅能增加细菌的肿瘤靶向性，而且可以显著增强基于细菌构建的癌症疫苗的免疫原性。而通过肿瘤靶向菌合成表达黏附素，可以显著增加细菌对实体肿瘤的黏附性，从而提高细菌的肿瘤靶向性。另外，针对肿瘤酸性微环境的特点，基因改造鼠伤寒沙门氏菌使STM1787启动子在酸性肿瘤微环境中优先被激活，从而驱动治疗性基因的表达，并借助于沙门氏菌特异性地定位于原发肿瘤和体内转移灶的特点达到治疗的目的。

除了利用肿瘤微环境低氧和低pH值的特点来改造细菌外，设计营养缺陷型细菌也是提高细菌靶向肿瘤性的常用方法。将鼠伤寒沙门氏菌A1菌株设计为亮氨酸/精氨酸营养缺陷型细菌，该菌在肿瘤中能获得充足的营养而定殖于肿瘤部位，而其在正常组织中由于缺乏必需氨基酸不能正常生长。脂多糖是导致细菌毒性反应的重要组分，敲除脂多糖基因的鼠伤寒沙门氏菌缺失突变体具有较好的肿瘤特异性和显著降低的致病性。

2细菌利用纳米材料及自身衍生物靶向成像和治疗肿瘤

纳米材料具有良好的肿瘤渗透性、EPR效应和较高的药物装载能力等特性，这使得纳米材料在肿瘤治疗方面具有重要的应用潜力。纳米材料具有较小的颗粒尺寸使其可以自由穿越毛细血管。EPR效应可以使纳米材料较多地滞留在肿瘤部位，但是肝脏和脾脏会截留70%以上的纳米颗粒。为了增强纳米颗粒的肿瘤靶向能力，可以在纳米颗粒表面修饰肿瘤靶向分子，如肿瘤细胞表面受体的抗体、亲合体、肽或者有机小分子物质等。

但是这些靶向分子的纯化与制备成本较高，修饰组分不稳定，只有部分颗粒能够到达肿瘤部位。而利用细菌独特的肿瘤靶向特性可以弥补纳米材料在肿瘤治疗中的不足。例如，研究者利用艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile）的孢子来携带纳米材料，通过纳米材料的抗体将药物和纳米材料结合。艰难梭状芽孢杆菌的孢子在有氧条件下无法生长繁殖，只有到达缺氧的肿瘤微环境中才能萌芽生长。这种以抗体为导向的策略显示了较好的治疗效果。

另外，通过电穿孔的方法将纳米材料导入到细菌内，同时在细菌表面镶嵌叶酸（folic acid），使其可与肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体结合而达到靶向肿瘤的目的，从而将更多的药物递送到肿瘤细胞中（图1）。为了提高肿瘤治疗的疗效和特异性，将低沸点全氟己烯包裹在与双歧杆菌结合的纳米颗粒中，在外界施加高强度聚焦超声，在液-气相变后破坏细胞来消除肿瘤。同时，利用阳离子聚合物包裹DNA形成阳离子纳米球，依靠静电相互作用吸附于鼠伤寒沙门氏菌表面，从而实现细菌靶向载运DNA疫苗免疫治疗肿瘤的目的。

另外，细菌在生长过程中会分泌外膜囊泡（out-er membrane vesicles，OMV），其通过细菌外膜突出而形成，携带有细菌的细胞质以及周质空间的物质。大部分囊泡外层包裹着脂多糖，这种小尺寸的微型细菌可以强烈地激活宿主的免疫反应。有研究者将大肠杆菌W3110菌株中的msbB基因敲除，抑制脂多糖的合成，可以显著降低细菌囊泡的毒性。

将DNA药物结合在纳米颗粒上，利用细菌囊泡将其携带进入肿瘤部位，经肿瘤细胞吞噬后，DNA药物被释放并可以在细胞中表达。通过电穿孔技术将纺锤体驱动蛋白的siRNA导入到表达了HER2（human epidermal growth factor receptor 2）affibody OMV中，其可以有效降低肿瘤细胞中纺锤体驱动蛋白的表达，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。过继转移和基因敲除研究证实，大肠杆菌产生的OMV的免疫保护作用主要是通过刺激T细胞免疫，诱导Th 1和Th 17细胞反应，从而有效降低细菌感染诱发的致死率。敲除细菌的细胞周期调控基因minCD，导致细胞非正常分裂而产生更多的细菌囊泡。同时，将酸性微环境靶向多肽展示在细菌的表面，可以使细菌靶向肿瘤酸性微环境，提高微细胞对肿瘤的靶向性。

另外，细菌纳米级衍生物质，如趋磁细菌产生的纳米磁小体，因具有独特的超顺磁性、高分散性和良好的生物相容性等特点，近年来被广泛用于肿瘤的成像和治疗。通过基因重组共表达抗HER2 affibody膜锚定蛋白MamC，利用MamC和磷脂双分子层的相互作用将affibody镶嵌到纳米磁小体的膜表面制备HER2靶向的纳米磁小体。

这种工程化纳米磁小体可以通过与肿瘤细胞表面过表达的HER2相结合，实现纳米磁小体在肿瘤部位的靶向聚集和磁共振T2成像。如果将纳米磁小体注射到荷神经胶质瘤的小鼠颅内，在交变磁场的作用下，纳米磁小体会产生热量杀死肿瘤细胞，40%的小鼠肿瘤会完全消退。同时，基于趋磁细菌自身磁导向性而进行的磁引导下的肿瘤靶向治疗已经兴起。如Magnetococcus marinus MC-1趋磁细菌中每一个细胞都含有一个磁性氧化铁纳米晶体链，会沿着局部磁场线移动，基于两态气动传感系统向低氧方向游动，可以在肿瘤中分布均匀，利用其载运含药物纳米脂质体，可以显著提高药物在肿瘤缺氧区域的浓度。

3细菌联合化疗、放疗和免疫治疗治疗肿瘤

3.1细菌载运化疗药物靶向治疗肿瘤

化疗是转移性癌症最重要的治疗手段，因为药物可以随着血液流动到达全身的各个转移灶，从而进行全身治疗。但是，由于实体瘤内部较高的间质性内压以及较少的血管分布，使药物无法进入肿瘤内部。同时，化疗药物不仅会杀死肿瘤细胞，还会影响到毛囊、骨髓和胃肠道等正常细胞的生理功能，诱发机体严重的毒副作用。

而增加化疗药物的肿瘤靶向性，可以有效降低其对正常组织细胞的损伤。多个研究证明，细菌可以载运化疗药物，实现对肿瘤的靶向治疗，减少药物对机体的毒副作用。例如，脂质体（lipidosome）包裹紫杉醇（pacli-taxel）药物，依靠链霉亲和素（streptomycin）与细菌外膜的生物素（biotin）结合，可以促进紫杉醇在肿瘤部位更多地聚集（图2）。

此外，设计温度敏感型的脂质体来包裹多柔比星药物，利用生物素-链霉亲和素将脂质体结合在鼠伤寒沙门氏菌的细胞膜上，通过鼠伤寒沙门氏菌的肿瘤靶向性将化疗药物更多地递送到肿瘤中，再借助于高强度聚焦超声进行加热诱导药物的释放，可以有效地抑制肿瘤的生长。而在小鼠黑色素瘤模型中，相比单独使用环磷酰胺药物，鼠伤寒沙门氏菌VNP20009与环磷酰胺联合治疗可以显著降低肿瘤微血管密度和血管内皮生长因子的含量。所以，相比于单独的化疗，细菌辅助化疗不仅可以增强肿瘤的治疗效果，而且可以降低化疗的毒副作用。

3.2细菌联合放疗治疗肿瘤

放疗主要是诱导肿瘤细胞的DNA发生损伤而杀死肿瘤细胞，而实体瘤内低氧微环境会显著降低放疗疗效。另外，有研究表明，放疗会引起肿瘤细胞发生保护性自噬，从而维持内环境的稳定性，使肿瘤继续增殖转移。将放射性同位素188Re通过抗体与李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）结合，将其注射到荷有高度转移胰腺癌的小鼠体内，同位素仅在肿瘤原发部位少量存在，而在转移灶中大量存在（图2）。通过饥饿反应，将32P渗入到李斯特氏菌中并注射到荷瘤小鼠体内，李斯特氏菌32P可以在肿瘤部位通过诱导的电离辐射和菌诱导的活性氧协同杀死肿瘤细胞。

3.3细菌联合免疫治疗杀死肿瘤细胞

免疫治疗作为新型的临床治疗方法已经逐渐成为癌症治疗的重要手段。有研究表明，接受免疫治疗后很多患者发生了3级或4级的不良事件，包括肝脏、胃肠道和肾脏疾病，还会使机体产生免疫耐受。癌细胞可以通过分泌免疫抑制细胞因子，募集免疫抑制细胞和呈递免疫检查点蛋白等途径来逃避机体的免疫系统。事实上，微生物对机体的免疫系统有着广泛的影响，它们不仅可以调节中枢神经系统组织驻留免疫细胞的成熟与功能，还影响外周免疫细胞的活化。利用细菌表达鞭毛蛋白与肿瘤抗原协同呈递给T细胞达到最优抗原呈递效果，促进CD4+和CD8+T细胞的活化，激发机体产生适应性免疫反应来抑制肿瘤生长（图2）。利用基因修饰技术使大肠杆菌编码表达CD47等纳米抗体拮抗剂，增加肿瘤浸润性T细胞的活化，可使肿瘤快速消退，并有效抑制肿瘤细胞的转移。