减毒沙门氏菌作为抗肿瘤及肿瘤基因治疗载体的研究进展

 

1、沙门氏菌的抗肿瘤研究

 

沙门氏菌是一类胞内侵袭革兰氏阴性兼性厌氧菌，在有氧及乏氧环境中均可生存，其本身也是一种天然的免疫佐剂，可诱导机体产生一些炎性因子来增强机体的先天保护性免疫反应。有关研究表明，沙门氏菌能优先选择性地在不同大小的肿瘤组织中聚集，形成集落，这是由肿瘤本身的微环境所决定的，但这种聚集的机制还没有完全阐明，目前认为可能是由肿瘤内部不同于正常组织的病理生理特点以及沙门氏菌自身的特性共同作用的结果。肿瘤组织代谢旺盛，营养丰富，肿瘤细胞生长迅速而供血相对不足，易形成低氧区和肿瘤坏死区，这为趋低氧代谢的沙门氏菌提供了一个大量聚集和繁殖的环境。

 

20世纪90年代，人们发现经肿瘤细胞传代筛选的高侵袭力营养缺陷型沙门氏菌具有直接抗肿瘤活性，并认为这种抑瘤作用是因为其释放的脂多糖(LPS)激发了免疫系统。1983年Takayama等将鼠伤寒沙门氏菌G30/C21注射至近交系豚鼠移植瘤内，对其有一定抑制作用，但不能完全治愈。1997年Pawelek等曾研究过沙门氏菌从远端接种部位对多发肿瘤的靶向性、肿瘤内的选择复制、肿瘤阻滞及表达有效基因的能力。虽然沙门氏菌本身抑制肿瘤生长的作用机制还不清楚，但普遍认为与菌体代谢产物激发机体的免疫反应，分泌多种细胞毒性效应因子和蛋白水解酶杀伤肿瘤细胞；沙门氏菌与肿瘤细胞存在竞争营养及生长因子，从而抑制了肿瘤的生长，及诱导肿瘤内细胞因子变化使肿瘤血管凝结，促进肿瘤包裹有关；另外Pawelek等还证明沙门氏菌毒力岛2（Salmonella pathogenicity islands 2，SPI2）的表达对于沙门氏菌发挥抗肿瘤效应是必需的。

 

2、减毒沙门氏菌的抗肿瘤研究

 

早期研究表明不仅沙门氏菌本身对肿瘤有直接的溶瘤作用，而且减毒株较野生株具有更好的靶向定植性。因而利用各种基因工程技术将沙门氏菌染色体基因组随机插入一个转座子或删除一段或几段致病基因可以实现毒力减弱而得到减毒菌株，在降低对宿主致病力的同时，仍可保留其高度的免疫原性，从而为临床应用提供了安全性保证。使利用减毒沙门氏菌选择性地在肿瘤组织内复制、增生来抑制多种肿瘤细胞的生长，延长动物存活时间成为可能。

 

Low等将减毒沙门氏菌通过耳静脉注射治疗腺瘤取得了较好的效果，但全身给予减毒沙门氏菌容易产生败血性休克。VNP20009是临床上研究较深入的减毒沙门氏菌菌株，其在临床Ⅰ期实验证实其具有较高的肿瘤靶向性和安全性。Zheng等将沙门氏菌减毒株VNP20009注射给多种荷瘤(鼠、人黑色素瘤，人结肠癌、肺癌、乳腺癌、肺肉瘤等)小鼠，发现细菌聚集在肿瘤部位是其他正常部位的200～1 000倍，并且肿瘤组织生长明显延缓。应用多种动物模型观察到该菌主要分布在动物的肝脏、脾脏和淋巴结等部位，30 d后只有肝脏可检测到，而40 d后无法检测到。应用该菌株表达的绿色荧光蛋白和脱氨酶也只在肿瘤细胞表达，而不在正常组织表达。同时，还发现只有活菌才能抑制肿瘤的生长，而经丙酮处死的细菌则不产生这种效应，这说明肿瘤坏死仅是由脂多糖造成的理由是不充分的。而且Low等还证明了这些减毒沙门氏菌的抗肿瘤作用可能不依赖于TNF-α。

 

肿瘤组织乏氧常导致放化疗失败，因此将减毒沙门氏菌与放化疗相结合，可弥补放化疗缺陷，降低肿瘤微血管密度和血管内皮生长因子（VEGF）的水平，促进肿瘤细胞的彻底清除。大多数化疗药物无法渗透到深层肿瘤组织，且往往对静止细胞无效，而沙门氏菌可克服这些障碍。沙门氏菌的这些特性将可能使沙门氏菌成为人类抗肿瘤的有力工具，在抗肿瘤基因治疗中占有一定的优势。Pawelek等用类脂突变的沙门氏菌联合化疗治疗小鼠恶性黑色素瘤的研究中发现，两者联合应用可以明显抑制小鼠肿瘤的生长，并延长小鼠存活的时间。Platt等将VNP20009与X线单独或联合进行动物实验，结果证明联合治疗可以产生协同作用。并且减毒沙门氏菌联合免疫治疗能克服肿瘤逃避机体免疫系统这一障碍。因此减毒沙门氏菌联合常规治疗方法是肿瘤基因治疗的一个发展模式。

 

3、减毒沙门氏菌作为肿瘤基因治疗载体的研究进展

 

3.1 减毒沙门氏菌

 

减毒沙门氏菌具有众多作为抗肿瘤理想基因传递载体的特征减毒沙门氏菌通过Ⅲ型分泌系统介导与宿主之间的反应，可传递效应基因并在细胞表面或胞浆中表达多种治疗性蛋白，诱导机体产生相应的特异性体液免疫、细胞免疫及局部黏膜免疫反应，抵抗携带相应外源蛋白的病原体入侵。携带外源基因的减毒沙门氏菌进入巨噬细胞和树突细胞后崩解死亡，释放出多拷贝的外源基因。外源基因表达，诱导机体MHC-Ⅰ分子介导的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞肿瘤保护性免疫反应，CTL和抗原提呈树突状细胞被激活，各自活化标志物CD2、CD25、CD28、CD48和CD80有决定性的增加。

 

由于减毒沙门氏菌不仅能在有氧及无氧的条件下生长，还能选择性聚集在肿瘤组织中，肿瘤内低氧坏死区可使这些细菌容易在肿瘤组织中繁殖扩散；同时由于对抗生素敏感，在必要情况下可以通过抗生素清除，不产生耐受性；加上具有良好的侵袭性和专一趋向性，可从远处接种部位移向并积集于肿瘤部位，在肿瘤组织中复制水平比正常组织高1 000~10 000倍；以及费用低，可通过口服途径给药，副作用小，适合长期治疗和可以传递表达多种效应基因，并结合其他方法发挥抗肿瘤的最大效应，长期维持直至肿瘤消退等等许多作为抗肿瘤理想基因传递载体的特征，这些特性为将沙门氏菌用作肿瘤基因治疗的靶向载体提供了可能。Kochi等指出，减毒沙门氏菌有可能成为新型的抗瘤制剂及肿瘤靶向治疗的载体。

 

目前有关专家已将减毒沙门氏菌作为基因转移载体应用于实体瘤、深部肿瘤及转移瘤基因治疗方面，在体外实验及动物模型实验中均取得了较满意的治疗效果，比如VNP20009是临床上研究较深入的减毒沙门氏菌菌株，其在临床Ⅰ期实验证实其具有较高的肿瘤靶向性和安全性。并且VNP20009可以抑制多种鼠源及人源移植瘤的生长，包括鼠、人黑色素瘤、人结肠癌、肺癌和乳腺癌等。部分成果已初步应用于临床，显示出了强大的发展前景。

 

3.2 携带细胞因子治疗肿瘤研究进展

 

细胞因子是机体抗肿瘤效应机制的重要组成部分，细胞因子可通过直接杀伤肿瘤靶细胞而激活抗肿瘤作用。IL-2、IL-12、IL-18、INF-γ、TNF和GM-CSF的抗肿瘤研究已经获得不少成功。Saltzman和Al-Ramadi发现携带IL-2的鼠伤寒沙门氏菌对小鼠和狗肿瘤有较强的抑制作用，且能有效降低肺转移瘤的形成。

 

而Low等构建带有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)的鼠伤寒沙门氏菌能在肿瘤细胞内高效表达有活性的CD，且能增强抑制肿瘤生长的效果。研究发现，IL-12和GM-CSF均具有良好的抗肿瘤作用，且两者合用可以明显增强抗肿瘤效果。但有报道指出GM-CSF会抑制IL-12的分泌。这表明沙门氏菌不但其本身能抑制肿瘤生长，而且能作为良好的外源基因表达载体在体内向肿瘤呈递药物蛋白。

 

带有人LIGHT的减毒鼠伤寒沙门氏菌在小鼠肿瘤组织中富集并表达LIGHT，能有效抑制原发乳腺癌、结肠癌及转移性肺癌。而载有FasL和IL-18基因的减毒鼠伤寒沙门菌也被证实有显著的抗肿瘤效果。Yu等证明口服表达鼠粒-单核细胞集落刺激因子(mGM-CSF)的减毒沙门氏菌使小鼠的尤文氏肉瘤消退，这种细胞因子能提高外周血的细胞毒T细胞的作用。Ursshi-ma等研究发现，口服表达CD40配体(CD40L)的减毒沙门氏菌能有效抑制B细胞淋巴瘤在小鼠体内的生长。

 

3.3 携带其他外源效应蛋白治疗肿瘤的研究

 

沙门氏菌能有效地传递多种效应基因并表达治疗性蛋白。Lee等将携带TSP-1基因的沙门氏菌减毒株用于治疗黑色素瘤与肺转移，发现细菌聚集在肿瘤部位是肝脏与脾脏的1000~10000倍，TSP-1在肿瘤部位的表达水平也是肝脏与脾脏的1800倍。这表明重组沙门氏菌能明显抑制肿瘤生长，延长小鼠的生存期并减少肿瘤内微血管的密度。Feltis等研究发现环加氧酶-2抑制剂与减毒沙门氏菌口服疫苗在抵抗结肠癌肝转移方面有协同作用。而含有CEA的VNP20009重组菌能增加肿瘤特异性定位，为提高表达肿瘤沙门氏菌的癌症疫苗的免疫原性奠定基础。

 

江中明等构建携带TIP30与人INF-γ基因的重组减毒沙门氏菌对腺样囊性癌具有明显治疗作用。而携带有siRNA-Stat3质粒的减毒沙门氏菌对小鼠肝原位移植瘤的生长具有显著抑制作用。人乳头瘤病毒HPV6b重组减毒沙门氏菌黏膜免疫小鼠后，阴道黏膜能分泌特异的抗人乳头瘤病毒HPV6bSigA。另外，表达VEGFR2的重组减毒沙门氏菌可诱导其产生VEGFR2的特异性免疫反应，能杀伤肿瘤血管内皮细胞，可治疗小鼠胶质瘤，且能抑制小鼠皮下肿瘤生长。

 

4、展望

 

尽管减毒沙门氏菌具有良好的基因传递载体优势，已在动物实验及临床I、II期实验中取得了较好的效果，但肿瘤基因治疗目前还处于发展早期，许多在动物实验观察到的结果尚不能在人体上完全实现，在临床应用中还存在许多困难。如：肿瘤基因治疗的途径是以全身给药最为可行，沙门氏菌为致病菌，其内毒素的致病作用不容忽视，并存在在血中大量繁殖引发菌血症的危险；沙门氏菌属于兼性厌氧菌，对乏氧组织的靶向定植特异性还有待于进一步提高。另外怎样将沙门氏菌载体高效地转移到人体肿瘤组织内部和进入静止期肿瘤细胞、怎样有效地减轻人体对重组载体的免疫作用及怎样有效地将基因治疗与其他治疗方法联合应用等，都是肿瘤基因治疗中所存在的难题。然而事实上，这些关键性问题都是目前肿瘤基因治疗研究的热点，并不断出现了新的进展。今后的研究应致力于通过分子生物学技术和基因工程技术以提高治疗基因的表达效率，筛选出靶向性更强、安全性更高的减毒沙门氏菌菌株。肿瘤的基因治疗在现代临床医学中拥有广阔的发展前景，必将在肿瘤的治疗中起到重要作用。

 

目前全球首创的溶瘤细菌载体产品是由港药溶瘤生物制药研发团队发明的经合成生物学改造的沙门氏菌YB1，YB1可以根据氧气的浓度差别识别肿瘤区域，实现靶向定植肿瘤区域。相较于溶瘤病毒，溶瘤细菌不需要依赖宿主细胞就可以生存并且增殖，而我们自主研发的细菌载体YB1依赖于肿瘤的低氧微环境，也可以入侵低氧微环境中的宿主细胞，包括但不局限于肿瘤细胞。因此我们在保证YB1的靶向性的同时，也增加了YB1在肿瘤内的适应性。

 

此外，由于基因组装载量大，溶瘤细菌还可以大量携带药物。以YB1为例，这个创新的载体产品就可以不依赖宿主细胞合成药物，因此YB1可以直接合成抗体，蛋白药物，mRNA疫苗等，并且可以实现药物的大面积全肿瘤区域覆盖。其实溶瘤细菌与溶瘤病毒同属于溶瘤载体这个范畴，因此也算一大类的新型免疫疗法，不过从二者差异性来看，还有一点就是在研发试验过程中，病毒一旦在人体内失控是很难终止或有效控制局面的，而溶瘤细菌YB1若在体内失控，则可以简单通过使用敏感抗生素来直接中止研究，且其作为细菌并无整合人类基因组的风险。

 

目前，公司已针对溶瘤细菌YB1的应用布局了多个产品管线，在YB1溶瘤细菌癌症免疫治疗领域，公司已有7个具体的在研药物管线，由YB1携带蛋白药物、抗体、mRNA疫苗以及溶瘤病毒等，可应用于多种实体瘤的临床治疗。目前已完成宠物原发癌症治疗的临床试验，效果非常显著，现已进入其人体临床试验申请阶段。另外，YB1除了可以应用于肿瘤治疗领域，同样可以用于各种血栓治疗。我们已就YB1应用于抗血栓治疗领域布局的3个在研产品管线，分别为第一代定点血栓消融产品YB1-rt-PA，及YB1携带重组降纤酶的YB1-rt-DE，以及YB1携带纤溶酶的YB1-rt-PL。

 

作为新兴溶瘤载体技术领域最前沿的研究成果，YB1在肿瘤治疗领域的成功应用有望为癌症治疗提供新的方案，我们亦希望通过专业科学的研究和创新药产品管线的开发落地，助力实现人类攻克癌症的百年愿景。