截至2021年，虽然已有多种细菌治疗肿瘤的案例报道，其中以卡介苗为代表的肿瘤细菌疗法在治疗和预防浅表性膀胱癌方面效果显著、临床安全，使其在诸多处于临床前研究和临床测试阶段的活菌制剂中脱颖而出，成为肿瘤细菌疗法的典范。
但就目前来说，肿瘤细菌疗法在临床开发中面临着两方面的关键挑战：一是如何在保证活菌药物生物安全性的前提下，提高细菌的肿瘤治疗能力。传统的基因工程技术不能系统性地修饰细菌功能，从而不能很好地平衡细菌毒力和肿瘤治疗效力之间的关系。例如，VNP20009虽然降低了沙门氏菌天然毒力，避免了细菌毒副作用，但却损失了细菌对肿瘤的抑制效果。
挑战二是解析细菌治疗肿瘤的现象背后潜藏的治疗机理，活菌药物是如何对肿瘤细胞起到杀伤作用的，至今仍是一个待解之迷。肿瘤微环境的复杂性，活菌制剂的不可控性都给更深入的分子机理研究带来严峻的挑战。近年来，合成生物学作为一门以理性设计生物行为为目标的学科快速发展，已成为更复杂、更精确地设计细菌行为的重要方法。
这种方法利用细菌作为模块化的工程平台，将基因和启动子元件合理设计组合，创造出微妙而复杂的基因线路，从而能够更精确地控制细菌的生理行为，加强对细菌的生物安全控制，调控细菌表达治疗分子的释放，增强细菌对疾病的治疗能力等。因此，合成生物学有望成为细菌疗法临床开发的助推剂，面对肿瘤细菌疗法在临床测试中面临的严峻挑战，提高细菌制剂的研发质量，强力推动肿瘤细菌疗法走向临床应用。
面向临床的生物安全性
目前，通过基因工程改造能够实现对细菌减毒或构建营养缺陷型菌株，从而限制细菌向正常组织器官扩散。这一策略在临床前药理学和毒理学测试中均显示出不错的安全性。
然而，为了获得更好的防治细菌逃逸效果，研究者并不仅仅满足于此。根据实体瘤内氧气浓度比正常组织低的特性，Li等利用氧气敏感启动子元件设计了一套基于“自杀开关”的合成生物学基因线路，构建了一株仅能在瘤内定植的专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1，由此规避细菌的逃逸风险。他们首先利用厌氧启动子PpepT驱动必需基因asd转录表达，再用需氧启动子PsodA反向驱动asd的转录表达，从而实现PsodA对PpepT启动子本底表达的抑制作用，确保一旦细菌逃脱瘤内扩散到正常组织，高氧气的环境会诱导PsodA抑制必需基因asd的表达，从而使细菌因不能合成细胞壁而“自杀”。实验结果也表明，在乳腺癌裸鼠模型中，YB1在瘤内的定植数量要显著高于正常组织器官内的数量。
此外，上述报道的活菌制剂SYNB1891不仅利用了厌氧启动子Pfnrs驱动STING激动剂环二磷酸腺苷基因dacA在瘤内的特异表达，还敲除了细菌胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因thyA和大肠杆菌合成细胞壁的关键基因dapA。相比于正常组织，实体瘤内的胸腺嘧啶核苷酸合成酶的浓度比较丰富，这就使得细菌在缺失thyA基因的情况下仅能在瘤内定植和复制；同时，细菌dapA基因的缺失使细菌丧失了合成细胞壁的能力，从而使细菌在进入机体后，会逐渐被免疫细胞清除。
这种对细菌关键基因的“双敲除策略”更近一步提高了细菌的生物安全性，大大降低了安全风险，也促使SYNB1891能够在临床安全风险评估中取得成功。另一种通过合成生物学理念增强细菌疗法临床安全性的策略是由Ho等开发的“合成生物学食用疗法”。
通过巧妙的设计重新编程EcN，使细菌能够在肠道组成型表达组蛋白样蛋白A(Histone-like protein A，HlpA)。其中，组蛋白样蛋白A能特异结合结直肠癌细胞上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan Sulfate Proteoglycan，HSPG)，同时EcN通过表达分泌黑芥子酶可以将患者食用的西兰花中的天然成分硫代葡萄糖苷(Glucosinolates)转化为抗癌小分子萝卜硫素(Sulphoraphane)。在小鼠结直肠癌模型的研究显示，该方法对鼠源和人源结肠癌细胞的抑制率高达95%。这种将可食用的西兰花和“益生菌酸奶”的联合疗法实现了将日常食物转化为癌症预防及治疗的药物分子，进一步确保了生物安全性。
提高肿瘤治疗的有效性
细菌可以用于治疗肿瘤的一个重要原因是其能够作为免疫激活剂扭转瘤内的免疫抑制微环境。早在150年前，William B.Coley研制的灭活细菌制剂——Coley’s Toxins从某种程度上来讲可能就是利用病原微生物进入体内后，打破体内原本“沉寂”的免疫微环境，激活免疫细胞杀伤细菌的同时也消灭癌细胞，从而对恶性肿瘤达到“以毒攻毒”的治疗效果。因此，研究者将Coley称为“癌症免疫疗法之父”。
合成生物学“自下而上”的设计理念，给予科学家极大的便利，通过改造细菌作为递送药物的智能载体，实现药物分子在瘤内不同层次的递送，从而达到调节免疫系统治疗肿瘤的目的。
目前已经报道的细菌可递送药物分子，包括溶血素A(ClyA)、FAS配体(FASL)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)等细胞毒性分子，IL-2、IL-18、CCL21等细胞因子，以及p53等调控因子等。其中，Zheng等基于鼠伤寒沙门氏菌ΔppGpp开发的一种组成型“智能”载药平台，能够使其表达及分泌创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)鞭毛蛋白FlaB，通过FlaB协同活化TLR5和TLR4信号通路，提高肿瘤抑制因子的分泌，显著增强免疫系统对结肠癌细胞的杀伤作用。
另外，为了改善细菌本身治疗肿瘤效果不佳的问题，本文作者团队提供了一种细菌与光热纳米颗粒的联合治疗策略。通过将光热纳米颗粒INPs偶联在减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株YB1上，开发出能够感应外界红外光强的“合成溶瘤菌”。相比于未结合纳米颗粒的对照菌株，细菌在瘤内的定植数量提高了14倍。同时，这种联合疗法不仅能够对细菌和肿瘤进行示踪和成像，还能有效提高对较大膀胱癌实体瘤(＞500 mm3)的治疗效果。
提高工程细菌在瘤内的群体定植能力是实现肿瘤治疗的关键步骤，但目前关于工程细菌定植能力的理性设计尚缺乏理论指导。基于合成生物学造物致知的理念，本文作者团队以大肠杆菌MG1655为模式生物，系统研究了细菌空间定植的进化稳定性策略，发现种群在不同大小生境的定植，都对应着一个最优的迁徙和生长策略，这为未来理性设计工程细菌瘤内空间定植提供了重要的科学依据和基础的理论指导。逻辑门控系统是合成生物学最具标志性的基因线路之一。逻辑门控系统有助于改造细菌实现其对两个或多个输入肿瘤相关信号的整合，以便特异表达具有治疗效果的功能性基因的输出，实现其在肿瘤诊断、预防和治疗方面的高度选择性应用场景。
Anderson等基于逻辑门控系统成功将大肠杆菌改造成具有肿瘤侵袭能力的合成工程菌。该系统应用双输入逻辑与门基因线路，设计大肠杆菌只有在感知到肿瘤内低氧气浓度和自身群体密度后，才会特异性输出表达来自假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuburculosis)的侵染素编码基因inv，使细菌能够侵入包括HeLa、HepG2和U2OS等癌细胞系。这篇具有里程碑意义的文章开创了合成生物学优化肿瘤细菌疗法的先河，为细菌疗法的优化带来了更多可能。
另外，为了获得更好的肿瘤治疗效果，可能还需要进一步优化细菌搭载药物分子可控释放能力。通过合成生物学手段构建的群体感应基因线路能够感知环境因素的变化，完成药物分子表达释放的智能切换，这套对基因表达智能精确的时空控制，有助于实现可控化的药物管理策略，增强抗肿瘤效果。
根据上述理念，Din等和Danino等构建了一套基于细菌载体表达抗肿瘤药物的同步化合成和裂解释放系统。这套系统不仅能够维持细菌在实体瘤内的定植数量，降低生物安全风险，还能在细菌数量增多后，完成细菌菌体的裂解和抗肿瘤药物的释放。小鼠实验显示，将具有群体感应系统的沙门氏菌与化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)联用，可以使小鼠的平均生存时间增加约50%，疗效提高正是得益于系统药物释放的同步周期性和稳定性。
应用同样的思路，该课题组通过改造一株非致病性大肠杆菌，在肿瘤微环境中特异性裂解并释放CD47纳米抗体拮抗剂达到治疗黑色素瘤的目的。CD47是一种抗吞噬细胞受体，通常在几种人类癌症组织中过表达。研究表明，通过群体感应裂解系统表达CD47纳米体拮抗剂可增加肿瘤浸润T细胞的激活数量，刺激肿瘤抗原特异性免疫反应，从而刺激肿瘤快速消退。
另外，该课题组还将群体感应裂解释放系统与免疫检查点抑制剂疗法联用，通过设计EcN在瘤内特异性周期化裂解表达PD-L1和CTLA-4拮抗剂，激活增强免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用，并在B细胞淋巴瘤小鼠模型上将肿瘤的抑制效果维持在15天以上。
总结与展望
虽然目前已有多种细菌制剂在动物模型中被证明具有治疗癌症的潜力，如梭状芽胞杆菌等专性厌氧菌，或者如沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌和大肠杆菌等兼性厌氧菌，但是这些菌株都还处于临床前或临床实验阶段，并没有达到预期的人体临床试验效果。究其原因，主要是由于活细菌制剂在临床评估中仍有一些挑战需要克服：
(1)如何确保细菌治疗肿瘤的安全性。将病原菌用于肿瘤治疗，可能会引起全身毒性副作用。确保细菌在瘤内特异性定植的前提下，降低细菌逃逸风险，是研究者在研发溶瘤细菌药物时需要优先考虑的问题。一种新的“合成生物学防护策略”是构建非天然氨基酸代谢依赖型菌株，使细菌无法在代谢途径上绕过生物防护机制。
虽然基因改造可能限制了细菌的致病性，但并不能保证基因改造模块的稳定性和基因线路的遗传稳定性。因此，在早期临床试验中，不仅要确保细菌对临床患者的生物安全性，也要确保细菌不会感染传播到密切接触者。故需要设置严格详密的监管框架和防护体系来规避上述风险，如样品采集程序、科学监测方法、应急处理方式等。
对此，FDA也于2018年发布了一份行业指南，旨在解决这些问题，以帮助研发者和实验人员设计合理的研究策略。另外，也需要特别考虑前期接受过常规放疗或化疗无效的癌症患者，这类免疫系统受损的患者若暴露于细菌感染，可能会导致巨大的风险，对生命安全造成不可控的结果。
(2)如何针对不同患者确定“个性化诊疗标准”。由于不同患者的年龄、身体素质、罹患癌症类型都不相同，如何确立溶瘤细菌药物的用药剂量、用药周期、给药后辅助药剂的选用等，都需要经过谨慎的求证和测试。特别是在患者肿瘤消退后，如何使用合适的方法来清除体内的细菌。抗生素可以作为一种行之有效的策略，然而，治疗后使用抗生素必须谨慎，因为过度使用抗生素会导致许多细菌产生耐药性，导致出现新的安全风险。
(3)如何确定合理的给药方式。给药方式的不同也会造成患者机体免疫响应的差异和副作用水平的不同，静脉滴注的方式虽然可以确保细菌制剂快速达到并定植于肿瘤部位，但也会对患者机体造成严重损害，引起败血症，危及生命。
目前，活细菌制剂在临床上的常用给药方式主要包括口服给药和局部给药等，如益生菌产品由于不存在细菌毒性，一般是选择口服给药的方式；但大多数活细菌肿瘤治疗制剂由于天然毒性的原因，临床研究者还是会优先采取局部给药，包括瘤内注射、瘤旁注射或如BCG一样采取膀胱灌注的给药方式。
综上考虑，从活细菌肿瘤治疗制剂的研发到临床前和临床试验的成功仍然是一段充满严峻考验的漫漫长路，还需研究者通过设计更严格、更合理、更科学的临床前基础研究来逐渐缩短这段距离。而随着合成生物学和肿瘤免疫学相关研究的不断发展成熟，以及现代生物技术的日益完善，肿瘤细菌疗法在未来必将取得重要突破，给癌症患者带来更多康复的希望，造福社会，造福于民！
