回顾肿瘤细菌疗法走过的百年历程，从最早外科医生的偶然发现(患者感染病原菌后肿瘤生长得到抑制)，到William B.Coley医生开发细菌制剂Coley’s Toxins用于肿瘤治疗，再到近二十年研究者通过基因工程改造细菌来提高肿瘤治疗效果，细菌疗法在肿瘤治疗中一直扮演着重要角色。近年来，随着合成生物学的蓬勃发展，研究者也在思考如何进一步优化肿瘤细菌疗法，为肿瘤治疗提供更多样化、更有效安全的策略。
肿瘤细菌疗法依赖自然界中细菌的毒力、自主运动能力以及对肿瘤的趋向性和侵袭能力等特征，使细菌具有调节肿瘤免疫微环境、诱导抗肿瘤免疫反应的能力。目前研究者依据细菌生物生理功能的不同，为治疗肿瘤提供了不同的干预策略。
此外，细菌基因组简单，易于进行工程改造，这也进一步提高了细菌对环境感应、特异靶向和智能递送药物等能力。上述特点赋予细菌为许多难治性、转移性癌症类型提供更好的解决方案的能力，加速了肿瘤细菌治疗药物在生物医药领域的研发进程和未来临床应用成功转化的可能性。
本文从肿瘤细菌疗法面向临床试验的角度出发，归纳总结了梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)、、沙门氏菌(Salmonella sp.)和大肠杆菌(Escherichia coli)等不同种属细菌在临床试验中的代表性研究进展和面临的瓶颈问题。重点介绍了合成生物学利用细菌作为模块化工程平台，设计微妙而复杂的基因线路，在提高细菌疗法有效性和改善临床生物安全性等方面的应用，从而弥补目前肿瘤细菌疗法在临床测试中的不足，助力细菌疗法突破瓶颈，推动临床试验进展。
肿瘤细菌疗法在临床测试中的范例
梭状芽孢杆菌
梭状芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，是最大的原核生物属之一，由于芽孢形态呈圆形或卵圆形，使菌体膨大呈梭状，所以被称为梭状芽孢杆菌。梭状芽孢杆菌是专性厌氧菌，因此，赋予了其在氧气匮乏的实体肿瘤坏死区域定植的能力。
此外，梭菌芽孢的萌发是由多种因素导致的，包括营养物质、酶、液体静压力或阳离子表面活性剂等，使其形成具有代谢活性的细菌细胞。目前已有多株梭状芽孢杆菌被报道应用于治疗肿瘤，包括溶组织梭状芽胞杆菌(C.histolyticum)、破伤风梭菌(C.tetani)、溶瘤梭菌(C.sporogenes)和丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum)等。梭状芽孢杆菌在肿瘤治疗中的应用历史可以追溯到1813年，外科医生Vautier首先观察到肿瘤患者在感染梭状芽孢杆菌后患上气性坏疽，但患者体内的肿瘤竟然消退了。
1935年，Connell首次使用来自溶组织梭状芽胞杆菌的细菌培养液干预治疗了30例癌症患者，结果发现肿瘤病情在部分患者上有所缓解。
1947年，Parker等首次将溶组织梭状芽胞杆菌用于治疗荷瘤小鼠，结果显示静脉注射细菌激发小鼠全身性免疫反应能在短期内延长小鼠寿命，但肿瘤并没有完全消退。1955年，Malmgren和Flanigan通过探究破伤风梭菌在小鼠各个组织器官和瘤内的定植数量，进一步证明了梭状芽孢杆菌对实体瘤的特异定植能力。在对小鼠注射高浓度剂量的破伤风梭菌孢子的48 h内，只有在实体瘤内检测到了破伤风梭菌，这说明了细菌孢子在实体瘤内定植的特异性。以上研究均表明，梭状芽孢杆菌具备肿瘤治疗的潜力。但由于梭状芽孢杆菌的天然毒力过强，其在肿瘤治疗中的应用也受到一定限制。对此，Dang等对包含双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸菌(Lactobacillus)和梭状芽孢杆菌在内的26种不同菌株评估了其在实体瘤厌氧区的特异定植能力。通过将细菌或梭菌孢子静脉注射入B16黑色素瘤荷瘤小鼠后，发现一株诺维氏梭菌(C.novyi)表现出优异的定植能力。
Dang等通过对该菌株加热诱导，在400多个细菌菌落中筛选到缺失致死性毒素基因的减毒株C.novyi-NT，从而降低了梭状芽孢杆菌在静脉注射后造成的全身毒性。减毒株C.novyi-NT的孢子仅在小鼠实体瘤的血管匮乏区域(厌氧区)出芽萌发，并破坏周围的肿瘤细胞。
另外，Dang等还开发了一种联合溶菌疗法(Combination Bacteriolytic Therapy，COBALT)，通过将C.novyi-NT孢子与常规化疗药物联合使用，显著延长了抗肿瘤作用的持续时间。这种细菌联合其他疗法的治疗策略不仅突破了常规化疗药物无法深入递送到血管匮乏的实体瘤内部的瓶颈，也开创了联合细菌治疗肿瘤的先河。虽然目前对梭状芽孢杆菌治疗肿瘤的机制尚未清晰，但有研究表明梭菌产生的诸如胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶以及磷脂酶、溶血素和脂肪酶等破坏肿瘤细胞的毒素可能在肿瘤治疗中发挥了积极作用。
另外，也有研究报道梭菌孢子可以在肿瘤细胞中萌发，诱导表达针对在肿瘤发展中起关键作用的转录因子——缺氧诱导因子-1(HIF-1)和不同细胞因子如TNF-α、IL-2和IL-12，从而抑制肿瘤细胞的增殖或转移。值得关注的是，减毒株C.novyi-NT在2019年完成了1期临床测试(NCT01924689)。测试中，对24例过往接受过化疗或放疗等常规方法且没有治疗效果的晚期实体肿瘤患者，接受单次瘤内注射6个递增剂量的C.novyi-NT的细菌孢子(1×104～3×106个/kg)，以确定剂量限制毒性(DLT)和最大耐受剂量。结果显示在24名患者中，单次肿瘤内注射C.novyi-NT后，10名患者(42%)的瘤内检测到细菌孢子出芽萌发，并导致肿瘤病灶减小。
沙门氏菌
沙门氏菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性胞内杆状菌。沙门氏菌能够在有氧条件下利用氧气或者在无氧条件下利用其他电子受体或以发酵的方式产生腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)，维持自身生理生长。沙门氏菌拥有诸多优良特性，使其成为肿瘤治疗中的模式微生物，包括依赖其鞭毛的自主运动能力、便于基因改造、天然的细菌毒力等。由于在临床上使用沙门氏菌具有高感染风险，所以如何平衡细菌过强的毒性和治疗效力是研究者急需攻克的难题。目前研究者对沙门氏菌进行了多方面的基因工程改造。
已报道的改造主要集中于降低细菌天然毒力、提高细菌肿瘤定植能力和降低细菌逃逸免疫系统监控的风险等，如鼠伤寒沙门氏菌菌株VNP20009、A1-R和ΔppGpp(SHJ2037)等。其中，VNP20009是基于野生型鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028底盘，通过基因工程改造的方式敲除了msbb基因，使细菌丧失了将脂质酰化为内毒素的能力，从而减少了内毒素的产生，降低了细菌毒性。另外，通过敲除参与嘌呤代谢相关基因purI，使细菌的增殖只能依赖于外源性的腺嘌呤，避免了细菌逃逸风险。鼠伤寒沙门氏菌菌株A1-R是在结肠癌小鼠模型中筛选得到的亮氨酸和精氨酸缺陷株，其在实体瘤坏死区有较强的定植能力，并对前列腺癌、乳腺癌和宫颈癌等都有很好的疗效。ΔppGpp(SHJ2037)是relA和spoT双基因突变菌株，relA和spoT的缺失导致了细菌不能合成ppGpp，从而丧失了细菌对哺乳动物细胞的侵袭能力。有文章报道ΔppGpp(SHJ2037)在小鼠结肠癌模型中具有良好的靶向能力，并改造其表达细胞毒性蛋白(Cytolysin A)，在小鼠原位瘤模型和肺转移瘤模型中表现出良好的治疗效果。
在上述菌株中，VNP20009是首例推向肿瘤治疗临床测试的沙门氏菌菌株。据报道，VNP20009在1期安全性临床测试中，对24名转移性黑色素瘤患者和1名转移性肾细胞癌患者静脉注射106～109 CFU/m2的VNP20009；结果表明，患者的最大耐受剂量为3×108 CFU/m2，在接受109 CFU/m2的注射剂量后，患者出现严重的剂量限制毒性，表现为血小板减少、贫血、持续性菌血症、高胆红素血症、腹泻、呕吐、恶心、碱性磷酸酶升高和低磷酸盐血症等。虽然VNP20009在临床测试中表现出良好的肿瘤定植能力，但并没有观察到病灶减小。因此，VNP20009由于在临床实验中不具备有效的肿瘤治疗效果而止步于1期。
益生菌——大肠杆菌Nissle 1917
大肠杆菌菌株Nissle 1917(Escherichia coli strain Nissle 1917，EcN)由外科医生Alfred Nissle于1917年在第一次世界大战期间从一名德国士兵的粪便中分离出来。之后，Alfred Nissle发现该菌株对不同致病性大肠杆菌具有强烈的拮抗活性。
EcN作为肠道益生菌具有许多优良的特性，赋予了其应用于肿瘤治疗的良好前景。首先，EcN具有生物安全性、对免疫系统敏感，不产生任何与致病性大肠杆菌相关的肠毒素或细胞毒素。同时，EcN膜上的血清敏感性脂多糖可确保该菌株能快速地被机体清除，且对患者没有严重的免疫毒性副作用。而EcN作为兼性厌氧菌，同样具备良好的实体瘤定植能力。
近年来，越来越多的报道表明EcN能够作为细菌药剂治疗肿瘤。例如，Zhang等报道了改造EcN组成型表达天青蛋白以抑制肿瘤的研究。在该研究中，患有原位B16黑色素瘤或4T1乳腺肿瘤的BALB/c小鼠以每只2×107 CFU的剂量静脉注射EcN，天青蛋白的释放和由此产生的炎症反应有效地抑制了肿瘤的生长和肺转移，并且细菌没有表现出显著的毒性。另外，He等通过氧气依赖性启动子控制EcN在实体瘤内特异性表达血管生成抑制剂Tum-5。结果表明，在静脉注射的14天内，表达Tum-5的EcN能在携带B16黑素瘤的C57BL/6小鼠中定植，并且肿瘤生长和血管生成被成功抑制。此外，该课题组还将能够表达抗癌蛋白p53的治疗模块加入到表达Tum-5的EcN中，赋予了EcN在小鼠原位肝癌肿瘤模型上更显著的抑制作用。
目前，EcN在肿瘤治疗临床测试上走得最远的是美国Synlogic公司研发的SYNB1891。SYNB1891是以大肠杆菌Nissle 1917为细菌底盘，利用其在肿瘤内的特异性定植能力，通过合成生物学改造，赋予EcN在瘤内特异性表达STING激动剂环二磷酸腺苷。STING激动剂可以激活抗原呈递细胞呈递肿瘤抗原，从而激活抗肿瘤免疫反应。SYNB1891对晚期转移性实体瘤和淋巴瘤患者(NCT04167137)的1期临床实验表现出良好的安全性；同时，患者在接受SYNB1891干预后，显示出STING通路激活，以及相关干扰素刺激基因、趋化因子、细胞因子和T细胞应答等上调；另外，2名转移性黑色素瘤和转移性小细胞肺癌治疗的患者接受治疗后，肿瘤也得到了持久稳定的控制。
这一临床测试结果证明了SYNB1891的安全性和肿瘤治疗的有效性，同时也有望弥补免疫疗法对大部分患者没有良好响应的缺陷。
卡介苗
卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)是由来自法国巴斯德研究所的Charles Calmette和Camille Guérin根据减毒的牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)悬液制成的活细菌制剂。他们通过将牛型结核分枝杆菌在含有胆汁的培养基中传代培养来实现分岐杆菌的减毒，并在传代超过1 000次后获得了供临床使用的减毒菌株。
起初，卡介苗的作用是为了治疗哮喘性支气管炎及预防结核病和结核性脑膜炎，直到1959年，卡介苗首次用于癌症免疫治疗，并在治疗及预防肿瘤中取得了很好的效果。1976年，卡介苗治疗佐剂首次成功应用于治疗复发性浅表性膀胱癌，这是具有划时代意义的研究成果。随后，卡介苗于1990年获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于临床治疗。直至40年后的今天，卡介苗已成为复发性浅表性膀胱癌治疗中最常用的佐剂。
虽然卡介苗治疗肿瘤的机理尚无定论，但主流的观点认为卡介苗是通过激活局部和全身的免疫反应来产生抗肿瘤效果。研究表明，卡介苗通过灌注的方式进入膀胱后，激活尿路上皮细胞和抗原呈递细胞，产生IL-1β、IL-8、IL-15和IL-18等细胞因子以及CXC趋化因子配体10(CXCChemokine Ligand 10，CXCL10)、GM-CSF等趋化因子，从而吸引中性粒细胞、巨噬细胞、CD4＋T细胞和CD8＋T细胞等免疫细胞的募集，这些免疫细胞通过产生活性氧中间体或。同时也有研究表明，肿瘤浸润性CD4＋T细胞数量的增加、CD4＋T细胞与CD8＋T细胞比率的增加都和肿瘤的治疗效果显著相关。
