第二代自体CD19靶向CAR-T细胞的成功临床试验获得FDA批准。这些产品目前的局限性是与CAR-T细胞疗法相关的制造时间和成本以及严重的毒性。从化学治疗难治性患者产生自体CAR-T细胞产物受到所获得T细胞质量以及患者自身生存时间的严重限制，因为制造过程需要2-4周(图2)。此外，患者在单采前必须进行两周的不治疗，以确保其在生产过程中具有足够的细胞数量和活力。
经常观察到神经毒性，免疫细胞相关的神经系统综合症(ICANS)和细胞因子释放综合症(CRS)，它们都是严重的疾病，如果不加以治疗可能会致命，特别是在CRS的情况下(图3)。
NK细胞的安全性及其抗肿瘤潜力，使它们成为实施CAR技术的有希望的细胞类型，可将其细胞毒性潜力重定向至特定靶标。生产可以普遍治疗患者的现成的CAR-NK细胞产品的可行性将显着提高给药速度，有效地减少从决定治疗和首次给药到1天的延迟时间。由于没有观察到或预期到CAR-NK细胞会产生严重的毒性，可通过“门诊”随访监测进行治疗，从而显着降低了因长期住院治疗而与CAR-T细胞疗法相关的巨大间接成本。
虽然诱导多能干细胞(iPSC)衍生的CAR-T细胞产物也可以作为现成的产物生产，但需要额外的基因修饰以去除内源性TCR，从而生产通用的产物而无需HLA匹配。尽管如此，通过使用iPSC衍生的CAR-T细胞并不能消除从CAR-T细胞疗法中观察到的严重副作用，这仍然需要治疗后的住院治疗。
最近对全球正在进行的临床试验进行的荟萃分析确定了520项有效试验，共检查了64种不同的CAR，其中96.4%的试验使用CAR-T细胞。因此，就将实验室研究转化为临床环境而言，CAR-NK细胞领域仍处于起步阶段。
在血液中，细胞毒性CD56dim NK细胞和免疫调节性CD56bright NK细胞构成了NK细胞的两个主要种群。与T细胞相比，NK细胞对基因工程具有相当的抵抗力，并且由于它们可以经历的细胞分裂数量有限，因此很难扩增为输注所需的大量细胞。为了缓解这些挑战，许多早期CAR-NK细胞研究已经用NK细胞系代替从脐带或外周血获得的原代NK细胞进行了研究。
NK细胞系(NK-92)
迄今为止，大多数CAR-NK细胞研究都是使用NK-92细胞进行的，包括大量当前的临床试验(表1)。尽管NK-92细胞在表型上类似于血液中发现的免疫调节且细胞毒性较弱的CD56bright种群，但它们在功能上具有高度细胞毒性。
它们的激活受体库包括NKp30，NKp46和NKG2D，它们的抑制库仅限于低水平的ILT-2，NKG2A和KIR2DL4。细胞表面缺乏抑制性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的表达，以及由于CD16表达低或不存在而无法通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀伤，大大区别了该细胞系与原代NK细胞。
这些缺陷导致将NK-92细胞进行基因工程改造以表达高抗体CD16受体，并合理地将表达CD16的NK-92细胞与抗肿瘤单克隆抗体结合在一起，以促进通过ADCC消除肿瘤。此外，相比于未修饰的NK-92细胞响应靶标暴露的相对较低的产量，许多研究都过度表达CAR的NK-92细胞中的IFN释放增加。
开发基于细胞系的CAR产品带来的优势是无限的增殖能力，并降低了对反复冷冻/融化循环的敏感性。这些特性允许制造通用的现货产品，从而大大减少了制造时间和成本。相反，基于细胞系的产品提出了新的安全性问题，NK-92细胞具有许多遗传异常，并有在输注后永久移植的潜力，因此绝对需要在输注前进行照射。大量研究表明，NK-92细胞在辐照后仍具有细胞毒性，但是缺乏体内增殖，会导致仅在7天后清除注入的细胞。因此，使用基于NK-92的CAR产品进行治疗很可能需要多轮输注。
脐带血NK细胞
从脐带血(CB)中分离出的NK细胞为CAR-NK产品提供了另一种可能的原料。CB淋巴细胞中有15%至30%是NK细胞，与外周血(PB)NK细胞相比，通常认为它们在表型和功能上更为幼稚。
据报道，CD16，颗粒酶B，穿孔素和KIR的表达降低，以及细胞粘附分子(包括CD2，CD11a，CD18和CD62L)的表达降低。通过KIR表达，有限的ADCC潜力和有限的功能成熟，以及粘附分子的减少，都有助于在该细胞群中观察到的降低的细胞毒性能力。
较高百分比的CB NK细胞为CD56bright，有助于抑制受体NKG2A的整体表达，该配体的HLA-E配体通常在肿瘤细胞上调，并且与不良预后相关。因此，NKG2A是重要的抑制性检查点，已被单克隆抗体疗法作为靶点，以释放头颈部鳞状细胞癌中NK细胞的潜能。与它们的不成熟特性一致，CB NK细胞具有更高的增殖能力，并且非常容易受到细胞因子的刺激。脐带血库使源自CB的NK细胞成为可行的起始产物，而从脐带血中获得的小体积则要求NK细胞经历大量的细胞分裂，然后才能获得足够的输液所需的细胞数。尽管如此，临床的CAR-NK细胞产品还是由CB NK细胞制成，目前正在临床中进行测试。
外周血NK细胞
大约90%的外周血NK细胞是具有细胞毒性的CD56dim NK细胞，可表达大量的抑制和激活受体。与CB NK细胞相比，PB NK细胞更成熟，导致功能增强，但增殖能力降低。在自体和同种异体环境下，来自匹配和HLA不匹配的NK细胞，以及匹配和KIR-配体不匹配的供体。使用来自不相关的HLA不匹配供体的细胞的可能性大大增加了可供选择的供体的数量，因此可以显着提高最终产品的质量。Apheresis是一种从健康供体血液中提取有核细胞的方法，通常通过CD3和CD19耗竭，有助于分离足够数量的NK细胞，然后通常通过细胞因子(例如，输注前IL-2或IL-15。尽管针对造血系统恶性肿瘤(主要是AML)的临床结果令人鼓舞，但临床反应已针对患者，并且难以根据临床前的体外研究进行预测。
iPSC衍生的NK细胞
NK细胞的第四个也是相当近期的来源是iPSC衍生的NK(iNK)细胞。iPSC衍生的NK细胞由于其无限的增殖潜力而成为现成的CAR-NK细胞产品的理想来源。相比之下，转导效率在制造CB或PB衍生的CAR-NK细胞中起着重要作用，并且仅需一个CAR诱导的iPSC细胞即可产生通用的现成CAR-NK细胞产物。但是，iPSC衍生的NK细胞仍处于起步阶段，要想生产出理想的现成产品，仍需要克服许多挑战。iPSC通常来自非造血细胞，例如成纤维细胞，产生的iNK细胞具有不成熟的表型，其特征是CD16表达低，NKG2A表达高，KIR表达低于PB NK细胞。这就提出了一个问题，即在遇到靶细胞后如何维持和释放它们的溶细胞潜力，这可以通过表达CAR构建体来解决。
与NK-92细胞类似，对iNK细胞进行基因工程改造以表达其缺乏的表面蛋白(例如CD16)是解决当前限制的一种潜在方法。尽管它们的增殖能力是无与伦比的，但在利用iPSC衍生的NK细胞的真正潜能之前，仍然需要解决输注后持续存在的问题。
第一个iPSC衍生的CAR-NK细胞产物FT596表达CD19-CAR构建体和高亲和力，不可裂解的CD16 Fc受体以及IL-15受体融合蛋白，并将与CD20-定向单克隆抗体治疗。
因此，该产品不仅解决了有限的持久性，而且还解决了iNK细胞CD16的低表达问题，并将组合免疫疗法付诸实践。来自CD19+淋巴瘤的人源化小鼠体内研究的有希望的临床前结果为最近列出的I期临床试验(NCT04245722)铺平了道路。
